CRISPR研究“再下一城”：南科大学者揭晓IV-A型CRISPR-Csf系统背后机制，有望用于临床疾病诊治

2023-07-29 06:58:02 来源：DeepTech深科技

(资料图片)

，目前在南方科技大学担任副教授，主要研究微生物与宿主免疫系统。2022 年，她曾入选《麻省理工科技评论》“35 岁以下科技创新 35人”亚太区榜单。图 | （来源：南科大官网）不到一年时间，好消息再次传来。前不久，她和合作者成功揭开 IV-A 型 CRISPR-Csf 系统的“神秘面纱”，让学界对于 CRISPR-Cas 系统的理解得以加深，为开发相关基因编辑工具并将其用于临床研究奠定了基础。研究中，借助生物化学、微生物学、结构生物学等手段，她和团队揭示了如下分子机制：细菌可以利用 IV-A 型 CRISPR-Csf 系统的免疫防御能力，抵御外源质粒的入侵。这一成果为了解 IV-A 型复合物的结构和功能做出重大贡献，也为进一步确定 IV-A 型 CRISPR-Csf 系统的体内功能铺平了道路。日前，相关论文以《IV-A 型 CRISPR-Csf 复合物：组装、dsDNA 靶向和 CasDinG 募集》（）为题发在 Molecular Cell（IF 16），CuiNing 是第一作者，和南科大副教授担任共同通讯作者。图 | 相关论文（来源：Molecular Cell）尽管投稿过程耗时一年多。但是表示：“最终，评审专家评价称我们‘用冷冻电镜解析了所有重要的功能状态，特别是首次捕捉到了 IV 型 Csf 系统与效应蛋白 CasDinG 复合物的结构，代表着 IV 型研究的一个重大飞跃’。看到这样的评价我真的很高兴，这是对我们工作的极大肯定。” （来源： Molecular Cell ） “神秘”的 IV 型 CRISPR-Csf 系统作为细菌的获得性免疫机制，CRISPR-Cas 系统能够“记住”曾入侵过的噬菌体或外源质粒，当后者再次入侵时，CRISPR-Cas 系统可以切断它们的基因组，让其无法复制和表达，从而抵御噬菌体或质粒等外源核酸的入侵。由于能够特异性地识别 DNA/RNA，CRISPR-Cas 系统已被开发成为一种高效的基因编辑工具，并被广泛用于生物技术、临床应用、基础研究等方面。研究 CRISPR-Cas 技术的两位科学家也因此获得 2020 年诺贝尔化学奖。同时，该技术曾经三次被 Science 评为年度十大科学进展，可见其在科学领域的重要意义。根据效应蛋白的组成，CRISPR-Cas 系统可被分为两大类：第一类（Class1）效应蛋白，是由多个 Cas 蛋白组成的复合物；第二类（Class2）效应蛋白，由单个 Cas 蛋白组成。目前，已经得到鉴定的 CRISPR-Cas 系统累计包含六种（I-VI）。除了 IV 型 CRISPR-Csf 系统外，其他类型的功能和作用机制，均已得到详细报道。其中，IV 型 CRISPR-Csf 系统是最为神秘的一类。该系统又可进一步分为从 IV-A 到 IV-E 等五种亚型。 IV 型 CRISPR-Csf 系统的特殊之处在于，它更多存在于质粒上而非存在于染色体上。并且，IV 型 CRISPR-Csf 系统对于同一宿主的其他质粒具有极强的靶向性，因此有可能会介导宿主中不同质粒之间的竞争。耐药菌感染，是当下临床治疗中的棘手问题。更严重的是，通过质粒水平的转移，耐药基因会在细菌中传播扩散，进而加剧微生物耐药所带来的公共卫生安全问题。近期，在临床分离的多种耐药肺炎克雷伯菌的质粒上，学界也发现了 IV 型 CRISPR-Csf 系统的存在。另外，有研究表明该系统可以靶向其他质粒中的转移基因，这暗示着 IV 型 CRISPR-Csf 系统可能具备对抗携带耐药基因质粒的能力。假如这一能力确实存在，将有希望用于耐药菌感染的治疗。而在目前已经得到鉴定的 6 类 CRISPR-Cas 系统中，IV 型 CRISPR-Csf 系统是唯一一种结构与功能均处于未知状态的系统。正是 IV 型 CRISPR-Csf 系统的神秘作用机制以及巨大的临床应用潜力，引起了等人的极大兴趣。

识别 IV 型 CRISPR-Csf 系统的“庐山真面目”

为了揭开该系统的“真面目”，该团队使用铜绿假单胞菌的 IV-A 型系统，来对效应蛋白进行共同表达。这时，效应蛋白会和 crRNA 形成效应复合物 CsfcrRNA。但是，课题组发现该系统的特征蛋白 Csf4（CasDinG）并不存在其中。接着，通过生化实验课题组证实 CsfcrRNA 可以特异性地识别靶 dsDNA，后又利用冷冻电镜单颗粒方法解析了 CsfcrRNA 与靶 dsDNA 结合复合物的冷冻电镜结构，借此揭示了 IV-A 型 CRISPR-Csf 系统的组装、crRNA 成熟以及靶 dsDNA 识别的分子机制。结构分析和生化实验的结果显示，相比 I、II、V 型 CRISPR-Cas 系统，IV-A 型 CRISPR-Cas 系统能够识别的 PAM 序列范围更广，这说明其具备广泛的 DNA 识别特性，暗示着其具有更大的应用价值。而在最初的复合物结构中，他们并没有发现 CasDinG 这一复合物。但是，在 IV-A 型 CRISPR-Csf 系统抵御外源质粒入侵时，CasDinG 发挥着必不可少的作用。为了探究 CasDinG 的具体功能，该团队又把 CasDinG 单独地纯化出来，通过 X- 射线晶体学技术解析了 CasDinG 的结构。后来，他们发现 CasDinG 是一种 5′-3′DNA 解旋酶，依赖于腺嘌呤核苷三磷酸（ATP）而存在。尽管 CasDinG 不能直接与 CsfcrRNA 形成复合物，但是 CasDinG 具有结合 DNA 的能力。于是课题组猜测：是不是 CasDinG 能被 CsfcrRNA-dsDNA 三元复合物所招募？为验证这一猜想，他们设计了不同版本的 dsDNA，最终证明上述猜测完全正确。更有意思的是，进一步的生化实验结果显示，在 ATP 的存在之下，CasDinG 能将靶 dsDNA 从 CsfcrRNA-dsDNA 复合物中解旋下来。为进一步探明上述现象，他们利用冷冻电镜解析了 3Å CasDinG-CsfcrRNA-dsDNA 的结构，发现 CasDinG 能够和不同的 Csf2 亚基相互作用，这说明 CasDinG 可能会沿着 Csf2 亚基进行滑动从而解开靶 dsDNA。而被解旋的单链 DNA，很有可能被细胞中的 DNA 酶所降解，从而导致目标质粒的降解。综合以上发现，该团队提出了一款模型，涵盖了 IV-A 型 CRISPR-Csf 复合物组装、靶向 dsDNA、招募 CasDinG 蛋白、以及 dsDNA 解离等过程。目前，应用最为广泛的基因编辑工具是 DNA 靶向的 CRISPR-Cas9 系统和 CRISPR-Cas12 系统，两者都属于第二类（Class2）效应蛋白，即只由一个效应蛋白组成，组成上相对简单因此更容易进行操作。但是，在识别 DNA 的时候，它们都得依赖靶向基因位点上特定的短 DNA 序列，这种序列的名字叫做 PAM 序列。并且，CRISPR-Cas9 系统和 CRISPR-Cas12 系统可以识别的 PAM 序列比较少，导致其适用范围较为局限。因此，开发新型基因编辑系统、拓宽 DNA 序列的编辑范围，是领域内的重要研究方向。虽然 IV 型 CRISPR-Csf 系统，是由多个蛋白组成的复合物。但是，用于编码这一系统的基因仅为 3159bp，比目前广泛应用的 spCas9（4104 bp）还要小。这意味着，IV 型 CRISPR-Csf 系统更容易被递送到细胞之内，临床应用潜力十分可观。而且，它能识别更加宽泛 PAM 位点，可编辑范围相对较大，适用范围也更广阔。此外，IV 型 CRISPR-Csf 系统也能存在于耐药菌株之中，故能和耐药基因相互关联。这样一来就能形成一个内源系统，从而有潜力用于对抗日益严重的耐药菌传播。同时，作为一种多亚基的复合物，IV 型 CRISPR-Csf 系统可以在多个位置耦联其他效应蛋白比如表观修饰酶、荧光蛋白等，进而能够带来更大的应用范围。如前所述，在所有 6 大类 CRISPR-Cas 系统中，针对 IV 型 CRISPR-Cas 系统的研究最为“模糊”。尽管此次研究揭示了该系统靶向目标 DNA 以及招募特征蛋白的机制。不过，目前依旧不清楚为何这一系统主要存在于质粒中，以及它和多重耐药菌的抗生素基因到底有何关系，也不清楚为何该系统的靶标更加偏好质粒而不是染色体 DNA。因此，课题组将围绕该系统与质粒 DNA 间的相互作用展开，进一步确定它的功能和作用机制。同时，也会尝试进行应用层面的改造，希望将来可以真正用于生物医药领域。（来源： Molecular Cell ）博后期间曾获一项美国化学奖另据悉，在加入南科大之前，曾在美国纪念斯隆凯特琳癌症中心做了三年多的博后研究。博后期间，她和当时所在团队阐述了古细菌的分子机制：即利用 RNA 靶向的 III 型 CRISPR-Cas 系统效应复合物，可以系统性地介导靶 RNA 降解、DNA 酶活调节、以及自身免疫调节来抵御噬菌体[2]。 CRISPR-Cas 系统可以通过识别、并降解入侵噬菌体的 DNA 或 RNA，来让外源基因的表达归为“沉默”。与此同时，噬菌体同样进化出了相应的防御工具 anti-CRISPR 蛋白，从而能以特异性的方式让 CRISPR-Cas 系统失去活力。基于上述工作，还和合作者揭示了 anti-CRISPR 蛋白 AcrVIA1 帮助噬菌体逃逸的分子机制。对于细菌来说，它能利用传统 CRISPR-Cas 系统所具有的核酸酶活性，降解外源入侵的核酸，从而抵御噬菌体的入侵。同时，核酸酶缺陷的的 I-F Cascade 系统，会被细菌用于 RNA 介导的 DNA 转座。而在博后期间的另一项工作中，和合作者阐述了细菌利用 Cascade-TniQ 复合物来识别靶 DNA 的机制[4]。上述工作揭示了细菌 CRISPR-Cas 免疫系统抵御外源核酸入侵的分子机制。凭借这些工作，她在博后期间获得了美国布拉瓦尼克区域青年科学家化学奖。如今，她回到国内任职已有两年之久。未来其将继续研究包含 CRISPR-Cas 系统在内的新型细菌免疫系统的分子机制，力争更好地助力于开发相应的生物技术工具，最终将其用于临床疾病检测与治疗。参考资料： 1.Cui, N., Zhang, J. T., Liu, Y., Liu, Y., Liu, X. Y., Wang, C., ... & Jia, N. (2023). Type IV-A CRISPR-Csf complex: Assembly, dsDNA targeting, and CasDinG recruitment.Molecular Cell.2.Mol. Cell, 2019a, 2019b, 2019c 3.Science, 2020 4.Cell Res., 2020

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